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        免疫組化過程及注意事項
        來源:本站 點擊數:1092次 更新時間:2016-1-2 23:34:01

        免疫組化技術在輔助病理診斷和鑒別診斷過程中經常起決定性作用,同時對腫瘤患者個體化治療及預后評估也起到了重要的指導性作用。

        免疫組化過程及注意事項

        1、組織固定目的是為了保存良好的組織形態及結構,防止組織自溶。所以標本離體后30min內應剖開固定或低溫保存,固定時間以8~24h為宜,4%中性甲醛滲透力強,固定均勻,抗原保存好,為首選固定液。

        2、玻片選擇對大多數病理科而言,一般多使用多聚賴氨酸的掛膠片,適用范圍廣,價格便宜;但有條件的科室可以選擇陽離子免疫組化玻片,效果更佳。

        3、組織切片石蠟組織切片要薄,厚度一般為3~4μm,無缺損、皺紋、折疊、氣泡,烤片溫度65~68℃,脫蠟要凈?酒筛邷鼗蛑貜秃婵,以防止抗原擴散及丟失。

        4、抗原修復直接影響免疫組化檢測結果的可靠性。在進行免疫組化染色時并非所有的抗原都要進行抗原修復,抗原性保存良好或基本保存者不需要修復。不同抗體必須選擇最適合的修復方法,最常用的是熱修復法,尤其是細胞核抗原經熱修復后,染色效果特別好。熱修復包括水煮加熱、高壓加熱和微波加熱3種。

        熱修復法影響抗原修復的關鍵因素有2

        ①溫度:高壓加熱時間為2~3min,水煮加熱時間為25~30min;

        ②修復液的種類和pH值:應與修復方法和修復時間相對應。所以必須嚴格按照抗體使用說明書進行抗原修復。鑒于抗原修復的方法較多,在實際工作中,究竟選用何種抗原修復,應根據抗體種類予以選擇,要清楚影響抗原的因素及各種抗原修復的方法,必要時可以多種方法同時使用,這樣更具有針對性,標記結果更理想。雖然有學者認為,修復液沸騰時的氣泡容易導致脫片,但組織處理不佳是最重要的影響因素。

        5、抗體的選擇及使用要選擇適宜的一抗,不同的二抗與一抗濃度不匹配,都不能得到滿意的結果。在滴加一抗、二抗時要先輕輕傾去PBS液,選用韌性好、吸水性強的紙巾吸干組織周圍液體,輕壓組織面吸干組織表面水分(不能滑動),防止試劑被稀釋或致濃度不均,立即滴加適量試劑,用細玻棒將試劑擴展至組織外1~2mm,防止出現邊緣效應,不能觸碰組織,液面厚約1mm為宜。試劑表面的氣泡用玻棒點破,否則氣泡張力作用會導致局部無試劑,出現氣泡下假陰性反應。濕盒孵育要定恒溫,整個過程均要防止干片,孵育時必須加蓋。

        6、顯色及復染DAB顯色劑須現配現用,10min內用完。顯色時間也不同程度影響免疫組化的質量,最好鏡下控制顯色,一般把握在3~5min,所以操作者應具備常用抗體定位的知識。顯色后用蘇木精復染,注意要淡染。

        容易被忽視的問題

        試劑的保存因為抗體是蛋白質,保存或使用不當不但會造成浪費,而且變質會出現假陰性結果。要注意抗體的有效期,對于一次用不完的抗體可保存在冰箱內,而不要放在冷凍室,反復凍融,抗體效價會急劇下降而失效。同時防止抗體的相互交叉污染和細菌污染。

        環境溫度標準實驗室溫度是18~22℃,實際工作中卻不然,條件差的實驗室冬天可低于12℃,夏天可高于37℃,冬夏溫差可達到25℃。一切酶促反應溫度最關鍵,反應程度也是冬夏季有別,這也是造成染色結果不穩定的一個重要原因,因此應該選用37℃恒溫箱進行孵育。

        異常染色結果及原因①脫片:黏膠玻片不合格、組織固定脫水透明不充分、切片太厚、實驗中干片等;

        ②花斑狀著色:脫蠟不凈、切片厚薄不勻、切片時組織下有氣泡或組織不規則松脫、試劑加樣時有氣泡或組織表面殘留水分太多、干片等;

        ③邊緣效應:指組織切緣非正常著色。因一抗二抗加量少,試劑沒有擴展至組織外或沒有在封閉濕盒中孵育,水分揮發使邊緣抗體濃度增大、組織邊緣松脫或干片;

        ④非特異性背景著色:染色過程中干片或沖洗不徹底;血清蛋白密封不充分;內源性過氧化物酶未完全阻斷;內源性生物素未阻斷(肝、腎、胰腺,含有中性粒細胞組織);固定不及時或固定不佳;切片太厚;緩沖液酸堿度未達標。

        綜上所述,人工免疫組化染色操作簡單,但人為及環境影響因素較多,必須有高度的責任心和嫻熟的操作技術,嚴格按操作流程操作,完善室內環境監控,盡可能的減少或杜絕人為和環境的干擾,才能取得滿意的結果。

         

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